재료준비
- 위의 Alizarin Red S sol.를 2%로 DIW에 녹이고 NH4OH (ammonium hydroxide)로 pH 4.1~4.3 맞추어 준다.
- 세포 고정을 위한 포르말린준비
10% Formalin sol. à 3.7 formaldehyde in DPBS (100% formalin = 37% formaldehyde)
- DPBS w/o Ca++, Mg++
- 10% Cetylpiridinium Chloride (CPC) (10mM Sodium phosphate buffer. pH 7.0로 맞춘 solution으로 녹이기)
- ddH2O
실험방법
1. 골분화된 세포의 배지를 모두 제거해 준다.
2. DPBS로 2회 워싱 해줌 반드시 DPBS로 워싱하여 칼슘과 마그네슘 이온이 없게함.
3. 10% formalin 15분간 상온에서 고정
4. 15분 뒤 10% formalin 석션 해주고, ddH20로 2번 워싱해줌.
5. Alizarin Red가 표면을 모두 덮을 수 있도록 뿌려줌.
6. 45분간 호일로 덮고 상온에서 염색함.
7. 마이크로 피펫을 이용해서 Alizarin Red 를 제거해줌
8. ddH2O로 4~5번 워싱
9. DPBS에 잠기도록 한 뒤 사진 찍기,
(Cell devri 때문에 찍기 힘들 수 있으니 dPBS에 오래 찍지 말거나 살짝 말린상태로 찍어도 무관함.)
10. DPBS 석션 후 CPC 10% CPC로 Alizarin red 추출
10. 96웰 플레이트로 옮기기
11. 흡광도 550nm에서 값 읽고 정량 적 비교.